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师兄这些年养细胞的秘诀,居然这么简单?

前方高能预警!还有 10 天,就是除夕啦~就要过年啦!然而,放飞的心儿飞走前,可万万别忽视了实验室里的细胞们,毕竟明年的 paper 还要靠这些小家伙们。 对于科研狗而言,操着一颗…


前方高能预警!还有 10 天,就是除夕啦~就要过年啦!然而,放飞的心儿飞走前,可万万别忽视了实验室里的细胞们,毕竟明年的 paper 还要靠这些小家伙们。


对于科研狗而言,操着一颗老母亲的心照料脆弱的细胞 Baby,冻存、复苏、传代等事宜要面面俱到……还要谨防天敌——支原体的入侵。


如果在细胞培养过程中你遇到如下问题:细胞增殖变慢、细胞间隙出现小黑点、培养液未见混浊但状态萎靡不振,SOS!这可能预示着你精心培养的细胞正在饱受支原体的摧残。



支原体是个磨人的「小」妖精


支原体是目前发现的最小细胞生物,由于支原体来源广泛(如操作人员、试剂、其它感染细胞),细胞培养过程中很容易引入污染源。据统计,4~92% 的真核细胞污染均是由支原体引起的。所以说,支原体污染是细胞培养过程中的普遍现象,是一种常态,而不是例外。


丝状支原体的 3D 结构
图片来源:G.T. Johnson et al. Nature Meth. 12, 85-91(2015)


支原体污染不但会导致细胞表型特征发生改变,且会引起细胞生长缓慢。更令人沮丧的是,它们对真核细胞的各项生物学特性例如增殖、凋亡等各方面的影响都非常宽广,常误导我们对于实验结果的判断。


除对细胞生物学实验的影响之外,细胞培养物还常用于生产生物活性物质。例如疫苗,支原体污染会导致疫苗失效,许多国家规定疫苗在投放使用之前需进行支原体检测。



支原体如何攻城略地


目前较为认可的支原体损伤细胞的主要方式有代谢途径及 DNA 降解。


1
代谢途径


支原体通过降解单糖来获取能量,该过程会产生酸性代谢物,从而改变细胞功能或诱导细胞病变;某些种类的支原体可以利用其精氨酸脱亚胺酶途径获得能量,会对感染的细胞产生如下危害:


  • 培养基中精氨酸的减少导致培养细胞的生长异常、活性降低,细胞从培养容器表面脱离,细胞颗粒化;

  • 还有一些研究表明在细胞分裂过程中,精氨酸脱亚胺酶可以将细胞周期停滞在 G1 期及 G2 期,与细胞凋亡有关,这可能是支原体引起细胞凋亡的一种方式。


2
DNA 降解


支原体缺乏合成其自身遗传物质前体的能力,需要利用核酸酶降解周围细胞的 DNA。因此,支原体污染会误导细胞凋亡研究结果,检测到的凋亡有可能是内切核酸酶产生的假阳性结果。


内切核酸酶降解 DNA
图片来源:Paddenberg R, et al. Cell Death Differ. 1998 Jun;5(6):517-28.



支原体「侦察记」


「小妖精」支原体在标准显微镜下不可见,并可通过 0.45 μm 滤膜,对抗生素不敏感,同时其不会造成培养基的 pH 值、颜色及浊度变化,故细胞被支原体污染后很难被观察得到。


目前支原体常用「侦察」方案例如微生物培养法、PCR 检测、ATP 活性法等,各有利弊,下面一表比较各种支原体检测方法。



R&D Systems® 的 MycoProbe® 支原体检测试剂盒(目录号 CUL001B)运用 RNA 探针与「夹心 ELISA」结合的方式,对样本中的支原体进行快速、准确的检测。该方法有效的改善了目前常规方法的不足,提供了一种敏感性高、无假阳性、高通量的支原体快速检测方式。


检测原理:


  • 杂交:样品中支原体的 16S rRNA 分别于生物素和地高辛标记的探针结合;

  • 捕获:预包被在孔板的链霉亲和素与生物素结合后将支原体 16S rRNA 锚定;

  • 检测:碱性磷酸酶(AP)标记的抗地高辛抗体与目标复合物上的地高辛结合后,通过底物显色得出结果。



试剂盒特色:


  • 准确度高:可检测出细胞培养体系中最常见的 8 种支原体感染(涵盖了 95% 的比例);

  • 敏感性高:可与 PCR 相媲美,且无假阳性;

  • 适合于高通量检测:96 孔板形式,可同时检测 96 份样品,灵活组合;

  • 适用范围广:细胞培养上清或/和培养细胞(新鲜及冻存细胞)裂解液,且不需无抗生素培养基;

  • 检测快速:约 4.5 小时完成检测;

  • 无需特殊仪器:即用型,操作简单。


MycoProbe®  支原体检测试剂盒进行 6 种细胞系上清及裂解液中的支原体检测


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文章来源:Bio-Techne

图片来源:Bio-Techne

本篇文章来源于微信公众号: 生物学霸

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